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链霉菌克隆载体质粒载体质粒名称大小.ppt

链霉菌克隆载体质粒载体质粒名称大小.ppt
内容要点:
链霉菌克隆载体质粒载体质粒名称大小,第四节细菌和链霉菌的分子克隆载体??????一、革兰氏阴性菌克隆载体1.?移动载体( mobilizable?vector)1)?特点i.??广谱宿主范围,即复制子和遗传标记具很宽适应范围ii.??DNA的转移常常需要经过中间宿主细胞和借助于辅助质粒, DNA进入中间宿主细胞可用直接转化2)?结构i.?RK2质粒的结构a.?oriV?DNA复制起点b.?DNA复制基因c.?DNA转移基因d.?oriT?DNA转移基因e.?药物抗性基因( Apr?Kanr?Tcr)G+菌的质粒和载体??ⅱ .?移动载体与辅助质粒pRK2013:?将 RK2中的全部转移基因和 Kanr基因插入到 ?E.coli的 colE1质粒中构成辅助质粒pRK290:?余下部分( Apr除外)构成移动载体(约 20Kb)*????当选用 E.coli为中间宿主时,必须先将 pRK290经过直接转化引入 E.coli( pRK2013也应转入同一细胞)。当要转移pRK290时,只需将 E.coli细胞与其他 G‐ 细胞混合,在pRK2013的作用下, pRK290可 接合转移 至终宿主细胞。3)??不相容群 ( incompatibilitiy?group) 克隆载体ⅰ .?P群: RP4??RK2??RP1?R68??????????????????2-5拷贝ⅱ .?Q群: R300B??RSF1010??R1162??????15-20拷贝ⅲ .?W 群: Sa???????????????????????????????????????????????2-5拷贝4) 遗传标记基因大多数为抗生素标记基因,要注意不同 G‐ 菌中的表达活性G-细菌中重组质粒的转移?2.?非移动载体 (non-mobilizable?vector)1)?特点 : 不能接合转移,但可经过直接转化进入那些可形成感受态的细菌,具有广谱和窄谱两大类载体2)?实例 : ?P4D0105-由 E.coli噬菌体 P4构建而成,适合于E.coli和肺炎克蕾伯氏菌。ⅰ .?当辅助噬菌体提供 P4整合酶时,该载体可整合到E.coli染色体中,整合入肺炎克蕾伯氏菌染色体则与整合酶无关。ⅱ .?该载体含有一个 virl突变和在引物酶基因 α中存在一个琥珀突变 (am52), 在无抑制子突变的菌株中,该载体不能自主复制,但在有抑制子突变的菌株中 (琥珀抑制子突变体),该载体则可自主复制。P4D0105载体的结构 ?二、革兰氏阳性菌( G+) 克隆载体1.枯草杆菌克隆载体1) B.subtilis作为宿主菌的优点ⅰ .?芽孢形成过程可用于阐明细胞发育过程ⅱ .?遗传背景较清楚,可直接导入外源 DNA?ⅲ .?非致病细菌,因而安全ⅳ .?研究结果可用于其它芽孢杆菌ⅴ .?存在各种分泌蛋白质2) B.subtilis作为宿主菌的缺点ⅰ .?存在多种蛋白酶基因和相应产物ⅱ .?外源 DNA导入细胞后不稳定,易发生重组反应?3)克隆载体ⅰ .复制子来源i)?质粒 DNA质粒名称 ?????大小 (kb)????标记基因 ?????拷贝数 ???????来 ????源pUB??????????????????4.5??????????????Kanr????????????????50??????金黄色葡萄球菌pE194???????????????3.7??????????????Eryr?????????????????10??????????????同上pC194???????????????2.9??????????????Cmlr??????????????????????????????????同上

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