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sdspage电泳过程中常见问题以及解决方法.doc

sdspage电泳过程中常见问题以及解决方法.doc
内容要点:
sdspage电泳过程中常见问题以及解决方法,SDS- PAGE 电泳过程中常见问题以及解决方法几乎所有蛋白质电泳分析都在聚丙烯酰胺凝胶上进行,而所有条件总要确保蛋白质解离成单个多肽亚基并进可能减少其相互间的聚集,最常用的就是 SDS-PAGE 电泳技术,关于大家在此过程中经常遇到的问题进行一些讨论:Q: SDS-PAGE 电泳的基本原理?A:SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS(十二烷基硫酸钠) , SDS 会与变性的多肽,并使蛋白带负电荷,由于多肽结合 SDS 的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关,因此 SDS 多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关,在达到饱和的状态下,每克多肽可与1.4g 去污剂结合。当分子量在 15KD 到 200KD 之间时,蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系,符合下式:logMW=K-bX,式中: MW 为分子量, X 为迁移率,k、b 均为常数,若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图,可获得一条标准曲线,未知蛋白质在相同条件下进行电泳,根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。Q:配胶缓冲液系统对电泳的影响?A:在 SDS-PAGE 不连续电泳中,制胶缓冲液使用的是Tris- HCL 缓冲系统,浓缩胶是 pH6.7,分离胶 pH8.9;而电泳缓冲液使用的 Tris-甘氨酸缓冲系统。 在浓缩胶中,其 pH 环境呈弱酸性,因此甘氨酸解离很少,其在电场的作用下,泳动效率低;而 CL 离子却很高,两者之间形成导电性较低的区带,蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比,这一区带便形成了较高的电压剃度,压着蛋白质分子聚集到一起,浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后,由于胶中 pH 的增加,呈碱性,甘氨酸大量解离,泳动速率增加,直接紧随氯离子之后,同时由于分离胶孔径的缩小,在电场的作用下,蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。所以,pH 对整个反应体系的影响是至关重要的,实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况,应首要考虑该因素。Q:样品如何处理?A:根据样品分离目的不同,主要有三种处理方法:还原 SDS 处理、非还原 SDS 处理、带有烷基化作用的还原 SDS 处理。1、还原 SDS 处理:在上样 buffer 中加入 SDS 和 DTT(或Beta 巯基乙醇)后,蛋白质构象被解离,电荷被中和,形成 SDS与蛋白相结合的分子,在电泳中,只根据分子量来分离。一般电泳均按这种方式处理,样品稀释适当浓度,加入上样 Buffer,离心,沸水煮 5min,再离心加样。2、带有烷基化作用的还原 SDS 处理:碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护 SH 基团,得到较窄的谱带;另碘乙酸胺可捕集过量的 DTT,而防止银染时的纹理现象。100ul 样品缓冲液中 10ul 20%的碘乙酸胺,并在室温保温 30min。3、非还原 SDS 处理:生理体液、血清、尿素等样品,一般只用1%SDS 沸水中煮 3min,未加还原剂,因而蛋白折叠未被破坏,不可作为测定分子量来使用。Q: SDS-PAGE 电泳凝胶中各主要成分的作用?A:聚丙烯酰胺的作用:丙烯酰胺为蛋白质电泳提供载体,其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否,与促凝剂及环境密切相关;制胶缓冲液:浓缩胶选择 pH6.7,分离胶选择 pH8.9,选择tris-HCL 系统,具体作用后面介绍;TEMED 与 AP:促凝作用,加速聚丙烯酰胺的凝固;十二烷基硫酸钠(SDS):阳离子去污剂,作用有四:去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。Q:提高 SDS-PAGE 电泳分辨率的途径?A:1

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