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091218 植物病原细菌学实验课件.ppt

091218 植物病原细菌学实验课件.ppt
内容要点:
三、作业1 简述 PCR反应基本原理及其操作注意事项B.混合物在 94℃ 下加热 5min 。C. 94 ℃ 变性 30秒种, 62℃ 退火 1分钟, 72℃ 延伸 2分钟,循环 30轮,进行 PCR。最后一轮循环结束后,于72℃ 下保温 10分钟,使反应产物扩增充分。2、电泳: 取 10 ul扩增产物用 1%琼脂糖凝胶进行电泳分析,检查反应产物及长度 。1、 PCR反应 :A. 取 0.5ml 的 eppendorf 管中依次加入效率试剂(共50?l) :35?l H20 5?l 10X PCR反应缓冲液4?l 25 mmol/L MgCl24?l 4种 dNTP0.5?l 上游引物(引物 1)0.5?l 下游引物(引物 2)0.5?l 模板 DNA(约 1ng)0.5ul Taq DNA聚合酶(约 2.5单位)混匀后离心 5秒钟二、实验内容和操作方法3)防止污染的方法?合理分隔实验室?样枪?预混和分装 PCR试剂?防止操作人员污染,使用一次性手套、吸头、小离心管应一次性使用 .?设立适当的阳性对照和阴性对照?减少 PCR循环次数?选择质量好的 Eppendorf管,以避免样本外溢及外来核酸的进入,打开离心管前 应先离心,将管壁及管盖上的液体甩至管底部 .开管动作要轻,以防管内液体溅出 .2)污染的监测?对照试验?阳性对照?阴性对照?重复性试验?选择不同区域的引物进行 PCR扩增5 PCR污染与对策PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性,但令人头痛的问题是易污 染,极其微量的污染即可造成假阳性的产生 .1)污染原因? 标本间交叉污染? PCR试剂的污染? PCR扩增产物污染 .? 实验室中克隆质粒的污染PCR延伸反应的时间,可根据待扩增片段的长度而定,一般 1Kb以内的 DNA片段,延伸时间 1min是足够 的。 3~4kb的靶序列需 3~ 4min;扩增 10Kb需延伸至 15min。延伸时间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增,延伸时间要稍长些。循环次数循环次数决定 PCR扩增程度。 PCR循环次数主要取决于模板 DNA的浓度。一般的循环次数选在 30~ 40次之间,循环次数越多,非特异性产物的量亦随之增多。②退火 (复性 )温度与时间:重要因素。 变性后温度快速冷却至 40℃ ~ 60℃ ,可使引物和模板发生结合。由于模板 DNA 比引物复杂得多,引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间,取决于引物的长度、碱基组成及其浓度,还有靶基序列的长度。③延伸温度与时间:PCR反应的延伸温度一般选择在 70~ 75℃ 之间,常用温度为 72℃ ,过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR反应条件的选择PCR反应条件为 温度、时间和循环次数 。温度与时间的设置: 基于 PCR原理三步骤而设置变性 -退火 -延伸三个温度点。①变性温度与时间:变性温度低,解链不完全是导致 PCR失败的最主要原因。一般情况下, 93℃ ~ 94℃ lmin足以使模板 DNA变性,若低于 93℃ 则需延长时间,但温度不能过高,因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性,就会导致 PCR失败。模板 (靶基因 )核酸 模板核酸的量与纯化程度,是 PCR成败与否的关键环节之一。Mg2+浓度 Mg2+对 PCR扩增的特异性和产量有显著的影响,在一般的 PCR反应中,各种 dNTP浓度为 200umol/L时,Mg2+浓度为 1.5~ 2.0mmol/L为宜。 Mg2+浓度过高,反应特异性降低,出现非特异扩增,浓度过低会降低 Taq DNA聚合酶的活性,使反应产物减少。dNTP的质量与浓度dNTP的质量与浓度和 PCR扩增效率有密切关系,

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